类器官来源于成体干细胞或多能干细胞，可分化为多种细胞类型，形成类似体内器官的结构。将类器官与微生物进行共培养，可以在体外重现宿主 - 微生物的相互作用，有助于深入理解微生物在健康和疾病中的作用机制。例如，肠道类器官可以与肠道微生物共培养，研究肠道菌群对肠道上皮细胞的影响，以及肠道上皮细胞对微生物的调控作用。
今天小编整理了一些关于类器官与微生物共培养的问题，希望能够对各位小伙伴有所帮助。
类器官可以与多种微生物进行共培养。
细菌：结直肠癌类器官与具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum, Fn）共培养后，可验证Fn的代谢产物（NaB）加强了PD-1抑制剂对肿瘤的杀伤效果[1];
病毒：Calvin J. Kuo等人[2]建立了顶端朝外的远端肺脏类器官，其暴露的外表面上表达ACE2促进了SARS-CoV-2感染，可作为人类远端肺部感染（包括与COVID-19相关肺炎）的体外类器官模型;
真菌：烟曲霉分生孢子或其细胞壁成分通过PRR信号通路触发肺类器官的强烈炎症反应，可为真菌性肺炎的机制研究提供模型[3]；
寄生虫：隐孢子虫可成功感染并定植于人小肠与肺来源的上皮类器官中，该类器官模型能支持寄生虫的侵入与存活，模拟生理性感染过程[4]。
目前，关于微生物感染类器官的方法主要有以下几种：
可以。目前在疫苗研发应用最广的是扁桃体类器官，利用类器官样本与流感等抗原共同孵育，结合基线血液和组织多维度测试，分析不同时间点免疫细胞组成和激活、抗体特异性以及中和能力等[17]
1. 为了确保微生物能在适宜的环境下与类器官进行共培养，需要避免添加抑制其生长的抗生素；
2.对于厌氧微生物的共培养，需要调整氧气浓度[5]；
3.根据微生物的需求，可额外补充碳源/氮源或其他代谢底物。
1、用荧光染料对微生物进行染色，有些可以追踪它们在共培养中的行为长达1周[5]。
图1. 显微注射法实现微生物与类器官共培养[5]
2、也可以采用电镜的方式直接观察[18]。
图2. 利用SEM（A）和TEM（B）观察被病毒感染前（Mock）和感染后6小时（6 hpi）的类器官纤毛部分，箭头部分为病毒[18]
3、还可以将类器官提取RNA，检测微生物的16S rRNA的表达水平，在宿主细胞的管家基因归一化之后即可表示感染情况[6] 。
图3. 检测16S rRNA表达水平评估细菌感染类器官的强度[6]
4、可以利用现有的滴度检测方法，如Rotavirus Fluorescent Focus Assay (FFA)可以检测轮状病毒的产量[19]。
大体流程是一样的，只是类器官的培养体系可能需要额外的操作步骤，如：对于非分泌型微生物，如果宿主类器官是包埋在基质胶内培养的，需要先将基质胶消化后，再进行收集或提取。
有这样的微生物，如：诺如病毒（Norovirus, NV）。诺如病毒于1972年由Kapikian等在美国诺瓦克市腹泻暴发事件中首次分离，NV只能使用类器官培养主要是有以下几个原因：
1、该病毒可在肠上皮细胞中检测到，但在传统细胞系中难以稳定复制；
2、该病毒具有高度物种专一性，无法通过常规实验动物模拟人类感染；
3、而经过实验验证，该病毒可以感染肠道类器官并且实现有限复制[20]。
基于类器官独特的3D结构，有些实验是无法用二维细胞完成的：
1、特定微生物的体外扩增只能在类器官中完成，如上文提到的诺如病毒[20]；
2、类器官的三维结构可以用于模拟体内的微生物定植环境，进行微生物定植相关的研究[21]；
3、细胞系的基础性质与它们来源的细胞有很大差异，如：肝细胞系与其相关的原代细胞进行比较时，观察到转录组学和蛋白质组学表达的偏差[22]，可能影响感染数据的准确性；
4、由于类器官的药敏测试与临床结果更接近，因此在抑菌/抑制病毒等药物的研发、以及引入免疫细胞后的免疫效果评估会更准确。
感染前的微生物最好做一些数量及活性的评估，以下步骤可按需选择：
1、确保微生物结构的完整性；
2、确保微生物的活力：细菌在感染前可以先做生长曲线，最好在对数期时使用；真菌可选择钙荧光白（CFW）染色确认活性；寄生虫可以在显微镜下确定数量与发育阶段，并在镜下观察蠕动或游动；
3、预实验确定MOI，之后可按需选择浓缩步骤。
Toshiro Sato等人[23]开发了一种名为 iHACS（肠道半厌氧共培养系统）的新技术，它可以模拟人类结肠上皮细胞和肠道厌氧菌的共生环境。该系统包含一个低氧的顶端室和一个常氧的基底室，允许厌氧菌在低氧环境下生长，同时维持上皮细胞的活力。
图4. 使用Transwell的肠类器官和厌氧微生物群的共培养体系示意图[23]
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参考文献
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